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Caractérisation des Virus-Like Particles par microscopie électronique en transmission


Figure 1Les Virus-Like Particles (VLP) sont produites en exprimant le code génétique des protéines structurales d'un virus dans un système d'expression in vitro, incluant les lignées cellulaires des mammifères, les lignées cellulaires des insectes, la levure et les cellules végétales. L'auto-assemblage des protéines structurales virales génère des particules qui ressemblent fortement aux virus dont elles sont dérivées. Elles peuvent être produites à faible coût et à un niveau de concentration et de pureté élevé (Figure 1). Ces propriétés en font d'excellents antigènes candidats dans les « vaccins du futur » et dans les tests sérologiques.


Les VLP ne contiennent pas de matériel génétique viral et ne sont donc pas infectieuses. L'inconvénient de ce caractère non-infectieux est que les tests virologiques conventionnels basés sur l'infection des cellules cible ne permettent pas de déterminer la qualité et la concentration des VLP. L'unité opérationnelle "Microscopie électronique" du CODA-CERVA développe et met en œuvre une approche systématique pour la caractérisation des VLP, en fournissant des analyses qualitatives et quantitatives aux partenaires internes et externes.


La coloration négative conjuguée à la microscopie électronique en transmission (MET) offre une résolution et un contraste suffisants pour visualiser les PPV en détail. Les analyses qualitatives incluent la description de la présence, de la pureté et de la morphologie générale des VLP (Figure 2), tandis que les analyses quantitatives incluent la mesure de leur taille et de la concentration en particules.

human norovirus like particles 1
human norovirus like particles 2

Plusieurs solutions commerciales ont été examinées et un logiciel expérimental a été développé pour détecter automatiquement les VLP dans des microscopes électroniques représentatifs. Certaines approcheadaptive tresholdings basées sur des modèles et fondées sur le prétraitement complet (filtrage) des images et une combinaison de détection des contours par filtrage de Canny et seuillage adaptatif ont permis de détecter toutes les particules typiques isolées sans faux positifs (Figure 3). Malheureusement, l'agglutination récurrente et les débris cellulaires ont fortement interféré avec tous les algorithmes utilisés, rendant les estimations automatiques du nombre de particules non fiables.


En conséquence, les concentrations de VLP sont maintenant estimées en se basant sur le nombre de particules présentes sur la surface de la grille du microscope électronique. Une interprétation par le microscopiste reste très importante pour éviter un résultat erroné dû à l'agglutination entre les VLP et les débris, pour évaluer la qualité de la préparation, pour la diluer si des concentrations trop élevées sont constatées et pour Figure 4interpréter les effets du changement de surface des VLP dus à la fixation (Figure 4). En général, la précision et la répétabilité obtenues sont supérieures à Log10.


Plusieurs centaines d'échantillons de VLP sont analysés chaque année. Parmi les VLP examinées citons les produits qui sont en voie d'être commercialisés en tant que vaccins, comme les pseudo-particules du parvovirus de porc, les pseudo-particules du calicivirus félin et les pseudo-particules du circovirus porcin, mais également de nouvelles VLP qui font partie des programmes de recherche exploratoire des entreprises et universités. Cette activité permet de se préparer de manière proactive à la caractérisation et au contrôle des générations futures de vaccins vétérinaires.

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