Afdrukken E-mail

Transmissie-elektronenmicroscopische karakterisering van virus-like partikels


Figure 1Virus-like partikels (VLPs) worden geproduceerd door de genetische expressie van structurele eiwitten van een virus in een in vitro expressiesysteem inclusief zoogdier- en insectencellijnen, gist, en plantencellen. Zelfassemblage van specifieke virale structurele eiwitten resulteert in deeltjes die sterk lijken op de virussen waar ze van afstammen. Ze kunnen goedkoop, in hoge concentratie en zuiver worden geproduceerd (Figure 1). Daardoor zijn het uitstekende kandidaat-antigenen voor de "vaccins van de toekomst" en voor serologische tests.


VLPs bevatten geen viraal genetisch materiaal en zijn dus niet besmettelijk. Een nadeel van deze non-infectiviteit is dat de conventionele virologische tests die gebaseerd zijn op infectie van target cellen niet kunnen gebruikt worden om de kwaliteit en concentratie van VLPs te bepalen. In de EM-eenheid van CODA-CERVA is een systematische methode ontwikkeld voor de karakterisering van VLPs. Deze routinematig gebruikte methode biedt kwalitatieve en kwantitatieve analyses voor interne en externe partners.


Negatieve kleuring gecombineerd met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) geeft voldoende contrast en resolutie om VLPs in detail te visualiseren. Kwalitatieve analyses omvatten beschrijving van de aanwezigheid, zuiverheid en algemene morfologie van VLPs (Figure 2), kwantitatieve analyses omvatten de meting van hun grootte en de numerieke concentratie.

human norovirus like particles 1
human norovirus like particles 2

Een aantal commerciële oplossingen zijn onderzocht en er is experimentele software ontwikkeld voor automatische detectie van VLPs in representatieve micrographs. Met template-benaderingen gebaseerd op uitgebreide pre-processing (filtering) van beelden en een combinatie van ‘Canny edge contour detection' en ‘adaptive thresholding' konden alle geïsoleerde, typische deeltjes zonder valse positieven worden gedetecteerd (Figure 3). Helaas interfereerden vaak voorkomende klontering en celdebris sterk met alle onderzochte algoritmes, wat automatische schattingen van het aantal deeltjes onbetrouwbaar maakteadaptive tresholding.


Om die reden worden concentraties van VLPs nu geschat op basis van het aantal deeltjes per rasteroppervlak. Een interpretatie door de microscopist blijft heel belangrijk om vervalsing door klontering tussen VLPs en celdebris te vermijden, om de kwaliteit van het preparaat te evalueren, om te verdunnen bij te hoge concentraties en om de effecten van het door fixatie variërend oppervlak van VLPs te interpreteren (Figure 4). Over het algemeen resulteert dat in een betere dan Log10 precisie en reproduceerbaarheid. Figure 4


Jaarlijks worden nu honderden VLP monsters geanalyseerd. Onderzochte VLPs omvatten producten die vermarktbaar zijn als vaccin, zoals porciene parvovirus-like particles, feliene calicivirus-like particles en porciene circovirus-like particles, maar ook nieuwe VLPs die deel uitmaken van de verkennende onderzoekprogramma's van bedrijven en universiteiten. Zo werkt CODA-CERVA proactief aan de karakterisering en controle van toekomstige generaties veterinaire vaccins, antigenen.

alt